Ultrafiltratsiyali santrifüj naychasidan foydalanish va ehtiyot choralari
1) Tegishli ultrafiltratsiya trubkasini tanlang.E'tibor bering, UF membranalari turli xil kimyoviy moddalarga chidamlilik darajasida farqlanadi.Odatda, molekulyar og'irligi 10 kDa bo'lgan ultrafiltratsiya quvurlari molekulyar og'irlik chegarasi bilan tanlanishi mumkin, bu qiziqish oqsilining molekulyar og'irligining 1/3 qismidan, masalan, 35 kDa dan oshmasligi kerak.Qiziqarli oqsilning molekulyar og'irligi 10 kd atrofida bo'lsa, molekulyar og'irlik chegarasi 3 KD bo'lgan ultrafiltratsiya naychasidan foydalanish mumkin.
(2) Yangi sotib olingan ultrafiltratsiya quruq bo'lib, ishlatishdan oldin o'ta toza suv qo'shiladi va membrana, muz hammomi yoki muzlatgichdan to'liq o'tgan suv bir necha daqiqa davomida oldindan sovutiladi.Keyin suv quyiladi, ya'ni oqsil suyuqligi va qancha qo'shiladi, qaysi biri naychaning yuqori qismidagi oq chiziqdan ko'p bo'lmasa.Operatsiya engil va ultrafiltratsiya trubkasini oqsil eritmasini qo'shishdan oldin muzda oldindan sovutish kerak.
3) Massa ham, tortishish markazi ham muvozanatga yetishi kerak edi.E'tibor bering, aylanish tezligi va tezlashuvi juda tez emas, aks holda ultrafiltratsiya membranasiga bevosita zarar etkazadi.Santrifugal ultrafiltratsiya boshlandi (tsentrifuga 4 darajagacha oldindan sovutilgan).Turli santrifugalarning aylanish tezligi g ga aylantirilgandan so'ng, u boshqacha edi.Santrifuganing tezlashishi minimal darajaga o'rnatilib, membrana bosimini pasaytirdi.Esda tuting, sentrifuga belgilangan tezlikka yetgandan so‘ng uni tark etishni unutmang yoki muammoga duch kelsangiz, uni birinchi marta boshqara olmaysiz.Membrananing shpindelga yo'nalishi ko'rsatmalarga muvofiq o'rnatildi (burchakli santrifuga korpusi membrana o'qiga perpendikulyar).Amaliy foydalanishda umumiy aylanish tezligi ko'rsatmalardagidan pastroqdir, shuning uchun santrifüj naychasining ishlash muddati uzaytirilishi mumkin.
3) Massa ham, tortishish markazi ham muvozanatga yetishi kerak edi.E'tibor bering, aylanish tezligi va tezlashuvi juda tez emas, aks holda ultrafiltratsiya membranasiga bevosita zarar etkazadi.Santrifugal ultrafiltratsiya boshlandi (tsentrifuga 4 darajagacha oldindan sovutilgan).Turli santrifugalarning aylanish tezligi g ga aylantirilgandan so'ng, u boshqacha edi.Santrifüjning tezlashishi minimal darajaga o'rnatilib, membrana bosimi kamaytirildi.Esda tuting, sentrifuga belgilangan tezlikka yetgandan so‘ng uni tark etishni unutmang yoki muammoga duch kelsangiz, uni birinchi marta boshqara olmaysiz.Membrananing shpindelga yo'nalishi ko'rsatmalarga muvofiq o'rnatildi (burchakli santrifuga korpusi membrana o'qiga perpendikulyar).Amaliy foydalanishda umumiy aylanish tezligi ko'rsatmalardagidan pastroq bo'ladi, shuning uchun santrifüj naychasining ishlash muddati uzaytirilishi mumkin.
(4) Qolgan 1 ml ga konsentrlanganda, 50 ul bufer eritmasini oling, 10 ul oqim qo'shing va ultrafiltratsiya trubkasida protein etishmayotganligini aniqlash uchun ko'k rang bor-yo'qligini tekshiring.Agar trubka oqayotgan bo'lsa, ultrafiltratsiyani boshlash uchun yuqori qatlamni qayta to'kib tashlang va yangi trubkaga o'tkazing.Naychalar o'tkazib yuborilganligini aniq aniqlash uchun oqishdan oldin 5 mgml BSA bilan 10 daqiqa davomida santrifüj qiling, oqsil elimida yoki Bredford xom tahlilida ishlaydi va qolgan konsentrlangan protein eritmasini (muz ustida ishlaydi va oqsillarni isitishni oldini oladi) qo'shish bilan davom eting. konsentratning hammasi qo'shilgan.Proteinlarning cho'kishi, naychaning yopilishiga olib keladigan bo'lsa, santrifüj paytida ehtiyot bo'ling.Agar yog'ingarchilik yuzaga kelsa, yog'ingarchilikning o'ziga xos sababi haddan tashqari protein konsentratsiyasi yoki noto'g'ri tampon ekanligini aniqlang;Birinchisini bir vaqtning o'zida bir nechta ultrafiltratsiya naychalarini ultrafiltratsiya qilish, konsentratsiyani pasaytirish, ikkinchisini esa oqsilning cho'kmasi paydo bo'lmaguncha turli xil bufer eritmalarini almashtirish orqali hal qilish mumkin.
(4) Qolgan 1 ml ga konsentrlanganda, 50 ul bufer eritmasini oling, 10 ul oqim qo'shing va ultrafiltratsiya trubkasida protein etishmayotganligini aniqlash uchun ko'k rang bor-yo'qligini tekshiring.Agar trubka oqayotgan bo'lsa, ultrafiltratsiyani boshlash uchun yuqori qatlamni qayta to'kib tashlang va yangi trubkaga o'tkazing.Naychalar o'tkazib yuborilganligini aniq aniqlash uchun oqishdan oldin 5 mgml BSA bilan 10 daqiqa davomida santrifüj qiling, oqsil elimida yoki Bredford xom tahlilida ishlaydi va qolgan konsentrlangan protein eritmasini (muz ustida ishlaydi va oqsillarni isitishni oldini oladi) qo'shish bilan davom eting. konsentratning hammasi qo'shilgan.Proteinlarning cho'kishi, naychaning yopilishiga olib keladigan bo'lsa, santrifüj paytida ehtiyot bo'ling.Agar yog'ingarchilik yuzaga kelsa, yog'ingarchilikning o'ziga xos sababi haddan tashqari protein konsentratsiyasi yoki noto'g'ri tampon ekanligini aniqlang;Birinchisini bir vaqtning o'zida bir nechta ultrafiltratsiya naychalarini ultrafiltratsiya qilish, konsentratsiyani pasaytirish, ikkinchisini esa oqsilning cho'kmasi paydo bo'lmaguncha turli xil bufer eritmalarini almashtirish orqali hal qilish mumkin.
(5) Proteinni konsentratsiyalash uchun dastlabki bir necha qadam qo'llaniladi va agar bufer o'zgartirilsa, taxminan 1 ml umumiy proteinga yangi buferni (0,22 um ultrafiltratsiya membranasi orqali ultrafiltratsiya) qo'shing va uch marta taxminan 1 ml ga qayta konsentratsiya qiling. ketma-ket marta, yakuniy konsentrlangan yakuniy hajm kerakli protein kontsentratsiyasiga qarab, odatda 500ul dan ko'p emas, balki 200ul ichida ham.Har safar kamida 10 × yoki undan ko'p hajmni boyitish orqali hisoblangan bufer o'zgarishiga uch marta 1000 × yoki undan ko'proq erishing.
(5) Proteinni konsentratsiyalash uchun dastlabki bir necha qadam qo'llaniladi va agar bufer o'zgartirilsa, taxminan 1 ml umumiy proteinga yangi buferni (0,22 um ultrafiltratsiya membranasi orqali ultrafiltratsiya) qo'shing va uch marta taxminan 1 ml ga qayta konsentratsiya qiling. ketma-ket marta, yakuniy konsentrlangan yakuniy hajm kerakli protein kontsentratsiyasiga qarab, odatda 500ul dan ko'p emas, balki 200ul ichida ham.Har safar kamida 10 × yoki undan ko'proq hajmni boyitish orqali hisoblangan bufer o'zgarishiga uch marta 1000 × yoki undan ko'proq erishing.
Yuborilgan vaqt: 09-noyabr 2022-yil