PCR, bu polimeraza zanjiri reaktsiyasi bo'lib, DNK polimeraza katalizi ostida tizimga dNTP, Mg2+, cho'zilish omillari va kuchaytiruvchi omillar qo'shilib, asosiy DNKni shablon sifatida va o'ziga xos primerlarni kengaytirishning boshlang'ich nuqtasi sifatida ishlatadi. Denatürasyon, tavlanish, kengaytma va hokazo bosqichlari orqali, DNKning asosiy zanjir shabloniga to'ldiruvchi DNKning in vitro replikatsiyasi jarayoni har qanday maqsadli DNKni in vitroda tez va maxsus kuchaytirishi mumkin.
1. Hot Start PCR
An'anaviy PCRda kuchaytirishni boshlash vaqti PCR mashinasini PCR mashinasiga qo'yish emas, keyin dastur kuchaytira boshlaydi.Tizim konfiguratsiyasi tugallangach, kuchaytirish boshlanadi, bu o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishiga olib kelishi mumkin va issiq ishga tushirish PCR bu muammoni hal qilishi mumkin.
Hot start PCR nima?Reaksiya tizimi tayyorlangandan so'ng, ferment modifikatori yuqori haroratda (odatda 90 ° C dan yuqori) reaktsiyaning dastlabki isitish bosqichida yoki "issiq boshlash" bosqichida chiqariladi, shuning uchun DNK polimeraza faollashadi.Aniq faollashuv vaqti va harorati DNK polimeraza va hot-start modifikatorining tabiatiga bog'liq.Bu usul asosan DNK polimeraza faolligini inhibe qilish uchun antikorlar, yaqinlik ligandlari yoki kimyoviy modifikatorlar kabi modifikatorlardan foydalanadi.DNK polimeraza faolligi xona haroratida inhibe qilinganligi sababli, issiq ishga tushirish texnologiyasi PCR reaktsiyalarining o'ziga xosligini yo'qotmasdan xona haroratida bir nechta PCR reaktsiya tizimlarini tayyorlash uchun katta qulaylik yaratadi.
2. RT-PCR
RT-PCR (teskari transkripsiyali PCR) mRNK dan cDNK ga teskari transkripsiya qilish va uni kuchaytirish uchun shablon sifatida ishlatish uchun eksperimental usuldir.Eksperimental protsedura birinchi navbatda to'qimalar yoki hujayralardagi umumiy RNKni ajratib olish, primer sifatida Oligo (dT) dan foydalanish, cDNKni sintez qilish uchun teskari transkriptazadan foydalanish va keyin maqsadli genni olish yoki gen ekspressiyasini aniqlash uchun PCR amplifikatsiyasi uchun shablon sifatida cDNA dan foydalanishdir.
3. Floresan miqdoriy PCR
Floresan miqdoriy PCR (Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR) real vaqt rejimida butun PCR jarayonini kuzatish uchun floresan signallarni to'plash va nihoyat, shablonni miqdoriy tahlil qilish uchun standart egri chiziqdan foydalanish uchun lyuminestsent guruhlarni PCR reaktsiya tizimiga qo'shish usulini nazarda tutadi.Tez-tez ishlatiladigan qPCR usullari orasida SYBR Green I va TaqMan mavjud.
4. Ichki PCR
Nested PCR ikki turda PCR amplifikatsiyasi uchun PCR primerlarining ikkita to'plamidan foydalanishni anglatadi va ikkinchi turning kuchaytirish mahsuloti maqsadli gen fragmentidir.
Agar birinchi juft primerlar (tashqi primerlar) mos kelmasligi o'ziga xos bo'lmagan mahsulotning kuchayishiga sabab bo'lsa, xuddi shu o'ziga xos bo'lmagan hududning ikkinchi juft primerlar tomonidan tan olinishi va kuchayishda davom etishi ehtimoli juda kichik, shuning uchun primerlarning ikkinchi juftligi bilan kuchaytirish, PCR ning o'ziga xosligi yaxshilandi.Ikki raund PCRni o'tkazishning afzalligi shundaki, u cheklangan boshlang'ich DNKdan etarli miqdordagi mahsulotni ko'paytirishga yordam beradi.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR - bu PCR sikli parametrlarini sozlash orqali PCR reaktsiyasining o'ziga xosligini yaxshilash usuli.
Tegishli PCRda dastlabki bir necha davrlar uchun tavlanish harorati primerlarning maksimal tavlanish haroratidan (Tm) bir necha daraja yuqori o'rnatiladi.Yuqori tavlanish harorati o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirishni samarali ravishda kamaytirishi mumkin, lekin ayni paytda yuqori tavlanish harorati primerlar va maqsadli ketma-ketliklarning ajralishini kuchaytiradi, natijada PCR hosildorligi kamayadi.Shuning uchun, dastlabki bir necha tsikllarda, tavlanish harorati odatda tizimdagi maqsadli gen tarkibini oshirish uchun har bir tsikl uchun 1 ° C ga kamayishi uchun o'rnatiladi.Yuvish harorati optimal haroratga tushirilganda, qolgan davrlar uchun tavlanish harorati saqlanadi.
6. To'g'ridan-to'g'ri PCR
To'g'ridan-to'g'ri PCR maqsadli DNKni nuklein kislotasi izolyatsiyasi va tozalashga muhtoj bo'lmasdan to'g'ridan-to'g'ri namunadan kuchaytirishni anglatadi.
To'g'ridan-to'g'ri PCRning ikki turi mavjud:
to'g'ridan-to'g'ri usul: oz miqdorda namuna oling va uni PCR identifikatsiyasi uchun to'g'ridan-to'g'ri PCR Master Mixga qo'shing;
kreking usuli: namunani olgandan so'ng, uni lizatga qo'shing, genomni bo'shatish uchun lizing, oz miqdorda lizizlangan supernatantni oling va uni PCR Master Mixga qo'shing, PCR identifikatsiyasini bajaring.Ushbu yondashuv eksperimental ish jarayonini soddalashtiradi, amaliy vaqtni qisqartiradi va tozalash bosqichlarida DNK yo'qolishining oldini oladi.
7. SOE PCR
Bir-biriga o'xshash kengaytmalar yordamida genlarni birlashtirish PCR (SOE PCR) PCR mahsulotlarini bir-birining ustiga chiqadigan zanjirlar hosil qilish uchun qo'shimcha uchlari bo'lgan primerlardan foydalanadi, shuning uchun keyingi kuchaytirish reaktsiyasida, bir-biriga yopishgan zanjirlarni kengaytirish orqali, kuchaytirilgan bo'laklar bir-biriga yopishgan A texnikasining turli manbalari. va bir-biriga bog'langan.Hozirgi vaqtda ushbu texnologiya ikkita asosiy qo'llash yo'nalishiga ega: termoyadroviy genlarni qurish;gen joyiga yo'naltirilgan mutatsiya.
8. IPCR
Teskari PCR (IPCR) ikkita primerdan tashqari DNK fragmentlarini kuchaytirish uchun teskari komplementar primerlardan foydalanadi va ma'lum DNK fragmentining har ikki tomonidagi noma'lum ketma-ketliklarni kuchaytiradi.
IPCR dastlab qo'shni noma'lum hududlarning ketma-ketligini aniqlash uchun mo'ljallangan va asosan gen promotorlari ketma-ketligini o'rganish uchun ishlatiladi;genlarning sintezi, translokatsiyasi va transpozitsiyasi kabi onkogen xromosomalarning qayta tuzilishi;va virus genlari integratsiyasi ham keng tarqalgan bo'lib hozirda qo'llaniladi. Saytga yo'naltirilgan mutagenez uchun plazmidni kerakli mutatsiya bilan nusxalash.
9. dPCR
Raqamli PCR (dPCR) nuklein kislota molekulalarining mutlaq miqdorini aniqlash usulidir.
Hozirgi vaqtda nuklein kislota molekulalarining miqdorini aniqlashning uchta usuli mavjud.Fotometriya nuklein kislota molekulalarining absorbsiyasiga asoslangan;real vaqtda lyuminestsent miqdoriy PCR (Real Time PCR) Ct qiymatiga asoslanadi va Ct qiymati aniqlanishi mumkin bo'lgan floresan qiymatiga mos keladigan tsikl raqamini bildiradi;raqamli PCR - bu nuklein kislotalarni hisoblash uchun yagona molekulali PCR usuliga asoslangan eng yangi Kantitativ texnologiya.
Yuborilgan vaqt: 2023 yil 13-iyun